欣諭冷凍干燥機(jī)在基礎(chǔ)工藝以及多肽領(lǐng)域的應(yīng)用
“欣諭”冷凍干燥機(jī)，凍干機(jī)，冷干機(jī)，真空冷凍干燥機(jī)是將含水物品預(yù)先凍結(jié)，然后將其水分在真空狀態(tài)下升華而獲得干燥物品的一種技術(shù)方法。經(jīng)冷凍干燥處理的物品易于長期保存，加水后能恢復(fù)到凍干前的狀態(tài)并保持原由的生化特性。對于材料如石墨烯，碳粉凍干，熱敏物質(zhì)如抗菌素、疫苗、血液制品、酶激素和其它生物制品如蛋白，多肽等，冷凍干燥技術(shù)更能顯示其優(yōu)越性。
“欣諭”品牌冷凍干燥機(jī)采用風(fēng)冷冷凝式制冷系統(tǒng)，冷阱可作預(yù)凍，不銹鋼結(jié)構(gòu)，透明干燥室，便于觀察冷凍干燥的全過程。 符合G際標(biāo)準(zhǔn)的綠色環(huán)保型；
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主先講講欣諭凍干機(jī)的凍干工藝
一、技術(shù)簡介： 
XY真空冷凍干燥是先將制品凍結(jié)到共晶點(diǎn)溫度以下，使水分變成固態(tài)的冰，然后在適當(dāng)?shù)臏囟群驼婵斩认?，使冰升華為水蒸氣。再用真空系統(tǒng)的冷凝器(水汽凝結(jié)器)將水蒸氣冷凝，從而獲得干燥制品的技術(shù)。 技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：（1）它是在低溫下干燥，不使多肽，蛋白質(zhì)、微生物之類產(chǎn)生變性或失去生物活力。這對于那些熱敏性物質(zhì)，如多肽，疫苗、菌類、毒種、血液制品等的干燥保存特別適用。 （2）由于是低溫干燥，使物質(zhì)中的揮發(fā)性成分和受熱變性的營養(yǎng)成分損失很小，是化學(xué)制品、藥品和食品的優(yōu)質(zhì)干燥方法。
（3）在低溫干燥過程中，微生物的生長和酶的作用幾乎無法進(jìn)行，能Z好地保持物質(zhì)原來的性狀。
（4）干燥后體積、形狀基本不變，物質(zhì)呈海棉狀，無干縮；復(fù)水時(shí)，與水的接觸面大，能迅速還原成原來的性狀。
（5）因系真空下干燥，氧氣J少，使易氧化的物質(zhì)得到了保護(hù)。 （6）能除去物質(zhì)中95～99%的水分，制品的保存期長
二、凍干流程
樣品預(yù)凍、升華干燥（第一干燥階段）、解析干燥（第二干燥階段）以及干燥后保存：
2.1樣品預(yù)凍階段： 2.1.1 預(yù)凍過程變化
溶液在冷凍過程中溶質(zhì)和溶劑存在一個(gè)相互分離的過程，大多數(shù)凍干藥品是以水為溶劑，所以以水為例來說明溶液的凝結(jié)過程。隨著溫度的下降到某一溫度時(shí)，水開始結(jié)晶，這時(shí)的溫度是制品的過冷溫度。由于結(jié)晶放熱，制品溫度開始升高后再下降，隨著水結(jié)晶的增加，溶液的濃度會(huì)增加（為了有利于干燥，一般凍干產(chǎn)品溶液配制成含固體物質(zhì)4%-15%的稀有溶液）。此外，根據(jù)產(chǎn)品的性質(zhì)不同，這時(shí)會(huì)有兩種情況：
一種是溶質(zhì)可以結(jié)晶的產(chǎn)品，隨著制品溫度的下降，稀溶液變?yōu)闈馊芤?，并逐步成為飽和溶液，溫度繼續(xù)降低時(shí)，由于溶解度降低，將會(huì)有溶質(zhì)析出，Z后成為冰晶體和溶質(zhì)晶體的共晶混合物，晶體的大小和冷凍速率有關(guān)，這時(shí)的溫度就是產(chǎn)品的共晶點(diǎn)溫度。這個(gè)過程也是一個(gè)放熱過程，在冷凍曲線上也出現(xiàn)過冷和平臺。
另一種是溶質(zhì)不結(jié)晶的產(chǎn)品，隨著制品溫度的下降，稀溶液變?yōu)闈馊芤?，溫度繼續(xù)降低時(shí)，溶液以玻璃態(tài)形式凍結(jié)，這時(shí)的溫度就是產(chǎn)品的凍結(jié)溫度。在冰晶的間隙中就形成了微觀的玻璃態(tài)結(jié)構(gòu)。
預(yù)凍會(huì)對細(xì)胞和生命產(chǎn)生一定的破壞作用，其機(jī)理是非常復(fù)雜的，一般認(rèn)為，預(yù)凍過程中水結(jié)冰所產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和溶質(zhì)效應(yīng)是引起生化藥品在凍干過程中失活或變性的重要因素。機(jī)械效應(yīng)是指水結(jié)冰時(shí)體積增大，致使活性物質(zhì)活性部位中一些弱分子力鍵受到破壞，從而使活性損失；溶質(zhì)效應(yīng)是指水結(jié)冰以后引起溶質(zhì)濃度上升以及由于各種溶質(zhì)在各種溫度條件下溶解度變化不一致引起pH值的變化，導(dǎo)致活性物質(zhì)所處的環(huán)境發(fā)生變化而造成失活或變性。
2.1.2 常見預(yù)凍方法及控制
冷凍方式要根據(jù)產(chǎn)品的特性，采用慢凍、快凍、預(yù)凍退火：
一般來說，預(yù)凍速度越快，形成的晶體顆粒越小，越有利于后期干燥的進(jìn)行，同時(shí)，一般制品預(yù)凍溫度在共熔點(diǎn)以下10-20℃保持2-3h，保證冷凍完全。預(yù)凍速度決定了制品體積大小、形狀和成品Z初晶格及其微孔的特性，其速度可控制在每分鐘降溫1℃左右。
對結(jié)晶性制劑而言，凍結(jié)速度一般不要太慢，凍結(jié)速度慢雖然便于形成大塊冰晶體，維持通暢的升華通道，使升華速度加快，但如果結(jié)晶過大、晶核數(shù)量過少、制劑的結(jié)晶均勻性差，也不利于升華干燥。對于一些分子呈無規(guī)則網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子藥物，速凍能使其在藥液中迅速定型，使包裹在其中的溶媒蒸汽在真空條件下迅速逸出，反而能使升華速度加快。因此，溶液的Z佳冷凍速度是因制劑本身的特性不同而變化的。如蛋白多肽類藥物的凍干，慢速凍結(jié)通常是有利的，而對于病毒、疫苗來說，快速降溫通常是有利。
控制： 1、探索Z佳預(yù)凍速率 2、合理控制預(yù)凍溫度
3、適當(dāng)控制及調(diào)整預(yù)凍時(shí)間
2.2升華干燥（干燥第一階段）
一次干燥（升華干燥）是指低溫下對制品加熱，同時(shí)XY凍干專用真空泵抽真空，使其中被凍結(jié)成冰的自由水直接升華成水蒸氣。待成品中看不到冰時(shí)，則可認(rèn)為一次干燥已完畢，此時(shí)制品溫度迅速上升，接近板溫，制品中Z初水分的90%以上已被除去。
在升華干燥過程中，制品吸收熱量后所含水分在真空下升華成水蒸氣，消耗大量熱能，使得制品溫度較板層溫度低十幾甚至幾十度。在該干燥過程中，如果溫度過高，會(huì)出現(xiàn)軟化、塌陷等現(xiàn)象，造成凍干失??；如果溫度過低，不僅給制冷系統(tǒng)提出了過高的要求，而且大大降低了升華過程的速率，費(fèi)時(shí)又耗能。
該過程中，主要把握溫度和真空度。干燥過程中，隨外界真空度變化，界面層傳熱性也會(huì)隨之變化，對于不同的產(chǎn)品特性，真空度大小不同，一般而言保持在10—30Pa（可依據(jù)實(shí)際情況作調(diào)整或在50—100Pa），與此同時(shí)，溫度的把握也至關(guān)重要。升溫速度及溫度保持時(shí)間，大多數(shù)而言，為保證樣品完整度，升溫速度可以控制在5℃/h，過快導(dǎo)致大量水分不能及時(shí)出去，造成制品溫度超過共晶點(diǎn)而融化。溫度限度上應(yīng)當(dāng)保持在共熔點(diǎn)或產(chǎn)品崩解溫度以下，以防止樣品復(fù)熔或塌陷。
升華階段結(jié)束標(biāo)志或判斷方法：1、外觀上，干燥層和凍結(jié)層交界面到達(dá)瓶底并消失 2、曲線，產(chǎn)品的溫度上升或者平行于導(dǎo)熱油溫度 2.3解析干燥
此階段為干燥第二階段，在第一階段干燥結(jié)束后，在干燥物質(zhì)的毛細(xì)血管壁和J性基團(tuán)上還吸附有一部分水分，這些水分是未被凍結(jié)的，當(dāng)他們達(dá)到一定含量，就為微生物的生長繁殖和某些化學(xué)反應(yīng)提供了條件。實(shí)驗(yàn)證明：即使是單分子層吸附以下的低含水量，也可以成為某些化和物的溶液，產(chǎn)生與水溶液相同的移動(dòng)性和反應(yīng)性。因此為了改善產(chǎn)品的儲存穩(wěn)定性，延長其保存期，需要除去這些水分。這就是解析干燥的目的。
第一階段是將水以冰晶的形式除去，因此其溫度和壓力都必須控制在產(chǎn)品共溶點(diǎn)以下，才不致使冰晶溶化。但對于吸附水，由于其吸附能量高，如果不給它們提供足夠的能量，如果不給它們提供足夠的能量，它們就不可能從吸附中解析出來。因此，這一階段產(chǎn)品的溫度應(yīng)足夠的高，只要燒毀產(chǎn)品和不造成主品過熱而變性就可，由于這一部分水分是通過范德華力、氫鍵等弱分子力吸附在藥品上的結(jié)合水，因此要除去這部分水，需要克服分子間的力，需要更多的能量。此時(shí)可以把制品溫度加熱到其允許的Z高溫度以下（產(chǎn)品的允許溫度視產(chǎn)品的品種而定，一般為25℃-40℃左右。病毒性產(chǎn)品為25℃，細(xì)菌性產(chǎn)品為30℃，血清、抗菌素等可高達(dá)40℃）。
三、常見問題及解決方法 如下圖：
典型的凍干產(chǎn)品塊，其中（a）是良好的產(chǎn)品塊（b）有硬殼或凍膠層的結(jié)構(gòu)不均一產(chǎn)品塊（c）自我支撐結(jié)構(gòu)弱的產(chǎn)品塊（d）部分塌陷的產(chǎn)品塊（e）復(fù)溶（f）消失的產(chǎn)品塊（g）凸起
如圖a?產(chǎn)品塊性質(zhì)應(yīng)該多孔而有彈性，并且一般表觀均一，包括結(jié)構(gòu)和顏色，。在有高過冷度(>10 ℃)的產(chǎn)品中，產(chǎn)品塊結(jié)構(gòu)良好，像壓好的藥片。凍干產(chǎn)品塊的體積應(yīng)該和填充液體的原始體積接近。圖b?是冷凍過程不合適造成的結(jié)構(gòu)不均一的產(chǎn)品塊。在該圖的底部是結(jié)構(gòu)良好的區(qū)域，表明一部分溶液經(jīng)歷了過冷。產(chǎn)品塊的中間部分是長針狀冰晶慢速生長的結(jié)果。該基質(zhì)的頂部是一個(gè)硬殼或凍膠層。硬殼或凍膠層不但阻礙 蒸汽從產(chǎn)品塊中流出，而且濃縮溶質(zhì)，使活性成分變性 的幾率變大?？梢愿淖兘禍毓に嚥⑹垢囿w積的溶液在 干燥過程開始前經(jīng)歷過冷來避免這種基質(zhì)。
圖c?是裂開的基質(zhì)。容器頂部附近的物質(zhì)是第二階段干燥階段物質(zhì)離開容器的證明。大多數(shù)情況下，斷裂基質(zhì)是由于固體物質(zhì)的百分比小于2%，產(chǎn)品塊的結(jié)構(gòu)脆弱造成的可以用減慢第二階段干燥的速度來限制物質(zhì)的損失，但是增加整體賦形劑的濃度來加強(qiáng)產(chǎn)品塊的結(jié)構(gòu)將是更好的選擇。塌陷和產(chǎn)品塊從容器壁凸起是典型的現(xiàn)象，在第一階段干燥過程中干燥溫度高于塌陷溫度時(shí)會(huì)發(fā)生這種情況。當(dāng)溫度高于塌陷溫度時(shí)，將有足夠多的自由水存在，使間隙物質(zhì)在第二階段干燥完成前移動(dòng)。消除這種基質(zhì)形成的Z好辦法是知道塌陷溫度并采取步驟確保第一階段干燥階段在該溫度以下進(jìn).
圖e?表示復(fù)溶。這種情況中，有足夠的自由水存在而引起產(chǎn)品塊的完全塌陷。在這種形式下，產(chǎn)品塊的復(fù)水可能耗時(shí)很長。知道融解溫度并調(diào)節(jié)第一階段干燥的溫度使其Z少在融解溫度以下5℃，可以避免復(fù)溶的發(fā)生.
多肽的保存
多肽一般是以凍干粉的形式保存，其在-20℃很穩(wěn)定，特別是冷凍干燥后并保存于-20℃干燥器中，大多數(shù)肽在此溫度下可以存放幾年不變。如果一次使用的肽量不多，Z好分裝成幾個(gè)小包裝，取用更為方便。為減少濕度的影響，在將凍干肽暴露于空氣之前，應(yīng)先將其在干燥的條件下恢復(fù)至室溫。當(dāng)無法冷凍干燥時(shí)，Z好的方法是以較小的樣量存放，并盡快使用。 對于含Met,Cys或Trp的多肽，脫氧緩沖劑對其保護(hù)必不可少，因?yàn)檫@種多肽易被空氣氧化，比較好的解決方法是可以在封瓶前，慢慢通入氮?dú)饣驓鍤饬鲝亩档脱趸饔?。?/span>Gln或Asn的多肽也容易降解，所以相對于其他不含此類氨基酸的多肽，其保存期較短。 多肽的溶解性
多肽的溶解性與其序列的組成有很大關(guān)系。一般來說，含親水性氨基酸較多的序列，其溶解性相對較好，這樣的氨基酸如：Lys, His, Arg等。含有疏水性較強(qiáng)的殘基如：Ala, Leu, ,Ile, Cys, Met, Phe和Val等將增加多肽溶解的難度。
大多數(shù)肽的主選溶劑是無菌的純凈蒸餾水。這些方法不溶的多肽， 需要乙腈、脲、DMF、鹽酸胍來溶解，但這些溶劑可能會(huì)對某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生副作用。
初次溶解時(shí)，一般使初始濃度大于要求濃度，如果多肽的溶解性有限，可以加入其它溶解劑或緩沖鹽。
如果多肽在水中的溶解性有限，有幾種選擇可幫助溶解： 超聲波處理
酸性肽用10%稀氨水（含Asp, Glu）
堿性肽用10%稀乙酸（含 Lys , His ,Arg） 疏水性強(qiáng)的肽用10%溶劑（乙腈、甲醇） J不溶的肽用DMSO或DMF溶解 鹽酸胍或脲的濃溶液也很有用。 多肽溶液的保存
溶液形式的多肽遠(yuǎn)比凍干形式不穩(wěn)定，溶液應(yīng)為中性pH(pH5-7), -20℃保存，為避免樣品的反復(fù)凍融， Z好分成小樣存放。一份樣品解凍后未用完， 應(yīng)扔掉，細(xì)菌降解有時(shí)會(huì)成為溶液肽的麻煩， 因此，肽應(yīng)溶于無菌水， 或肽溶液用0.2μ M濾膜過濾，后再置于-20℃保存更好。
多肽的含量與純度
多肽的含量與多肽的純度是兩個(gè)完全不同的概念。多肽的含量反映的是凍干肽中多肽與其它組分的關(guān)系。
而多肽的純度則是反映了目的肽與其它雜肽的純度關(guān)系。多肽的純度可以通過計(jì)算在紫外檢測下（210-220nm）從HPLC色譜中洗脫出的物質(zhì)的主峰的面積百分比獲得。
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